mRNA疫苗：疫苗學的新時代

編譯 | 王聰

2018年1月12日，Drew Weissman教授在Nature Reviews Drug Discovery期刊發表了一篇綜述【1】，描繪了一種有前途的mRNA疫苗的未來。此時的他或許不會想到1997年時和Katalin Karikó在實驗室複印機前的一次爭吵會爲20多年後拯救世界埋下伏筆。

Drew Weissman（左）、Katalin Karikó（右）

當時兩人爲搶一臺複印機發生爭執，也因此結識，此後的交流中，他們發現彼此對mRNA有着相似的看法，並開始合作研究，2005年8月1日，兩人合作的論文在Immunity期刊發表【2】，他們對mRNA進行假尿嘧啶化修飾，大大增強了mRNA在體內的穩定性。

後來的事情我們都知道了，新冠疫情暴發，mRNA疫苗橫空出世。

這篇綜述發表於2018年1月，此時mRNA的理論研究已經完善，mRNA在體內的不穩定和遞送的低效率問題已經基本得到解決，針對幾種傳染病和癌症的mRNA疫苗臨牀試驗也已經展現了令人鼓舞的效果。

Drew Weissman教授詳細概述了mRNA疫苗，並闡述了將這一有前途的疫苗平臺推向廣泛預防和治療用途的未來方向和麪臨的挑戰。

疫苗，每年可預防數以百萬計的疾病並挽救無數生命。由於廣泛使用疫苗，天花病毒已被徹底根除，脊髓灰質炎、麻疹和其他兒童疾病的發病率在世界範圍內大幅減少。傳統的疫苗方法，例如減毒活病原體和滅活病原體以及亞單位疫苗，可提供針對各種危險傳染病的持久保護。儘管取得很多成功，但針對各種傳染性病原體的疫苗開發仍然存在重大障礙，尤其是那些能夠更好地逃避適應性免疫反應的病原體。此外，對於大多數新興病毒的疫苗而言，主要障礙不是傳統方法的有效性，而是需要更快速的開發和大規模部署。而且，傳統疫苗方法可能不適用於非傳染性疾病，例如癌症，因此，迫切需要開發更有效和通用的疫苗平臺。

早在1990年，就有研究表明，將報告基因mRNA注射到小鼠體內，能夠檢測到蛋白質的產生。1992年的一項後續研究表明，在大鼠下丘腦中注射編碼加壓素的mRNA可引起大鼠的生理反應。然而，這些研究並未激起開發mRNA療法的熱潮。這主要是來自對mRNA不穩定性、高先天性免疫原性和體內遞送效率低下的擔憂。此時科研界追求的是基於DNA和蛋白質的治療方法。

此後的數十年裡，許多重大技術創新和資金投入使得mRNA疫苗逐漸成爲一個有前景的疫苗平臺。與亞單位疫苗、滅活病毒疫苗和減毒活病毒疫苗以及基於DNA的疫苗相比，mRNA疫苗具有幾種顯著優點：

1、安全性：由於mRNA是一種非感染性、非整合性平臺，因此不存在感染或插入突變的潛在風險。此外，mRNA會被正常的細胞過程降解，其體內半衰期可以通過使用各種修飾和遞送方法進行調節。還可以下調mRNA的固有免疫原性以進一步提高安全性。

2、有效性：各種修飾使mRNA更加穩定和高度可翻譯，通過將mRNA構建到載體分子上，可以在細胞質中快速攝取和表達，從而實現有效體內遞送。mRNA是最小的遺傳載體，因此，避免了抗載體免疫反應，並且可以重複使用。

3、生產效率高：mRNA疫苗具有快速、廉價和可擴展製造的潛力，主要是由於體外轉錄反應的高產率。

mRNA 疫苗代表了傳統疫苗方法的有前途的替代品，因爲它們具有高效力、快速開發的能力以及低成本製造和安全管理的潛力。

基礎mRNA疫苗藥理學

mRNA，也叫信使RNA，負責傳遞DNA中儲存的遺傳信息，指導細胞中蛋白質的合成。而mRNA疫苗就是使用mRNA來指導細胞產生相應的蛋白質，從而預防和治療疾病。

目前主要有兩種類型的RNA作爲疫苗：非複製mRNA和病毒來源的自擴增RNA。

傳統的基於mRNA的疫苗編碼感興趣的抗原幷包含5‘和3’非翻譯區，而自擴增RNA不僅編碼抗原，還編碼病毒複製相關基因，從而實現細胞內RNA擴增和更豐富的蛋白質表達。

裸露的mRNA會在細胞外就被RNA酶迅速降解，難以有效進入細胞內。現在已經開發了多種體外和體內轉染試劑，以及RNA修飾，以促進細胞對mRNA的吸收並防止其降解。

一旦mRNA被轉移到細胞質中，細胞翻譯機制就會產生經過翻譯後修飾的蛋白質，從而產生正確摺疊的全功能蛋白質。mRNA藥理學的這一特徵對於需要將胞質或跨膜蛋白遞送到正確的細胞區室以進行適當的呈現或功能的疫苗和蛋白質替代療法特別有利。體外轉錄的mRNA最終會被正常的生理過程降解，從而降低代謝物毒性的風險。

mRNA翻譯和穩定性優化

編碼序列側翼的5‘和3'UTR元件深刻影響mRNA的穩定性和翻譯，這兩者都是疫苗的關鍵問題。這些調控序列可以來自病毒或真核基因，並大大增加治療性mRNA的半衰期和表達水平。

從mRNA高效生產蛋白質需要5’端帽子。可以在使用痘苗病毒加帽酶的轉錄反應期間或之後添加各種版本的5‘端帽子或通過將合成的帽子或類似物。poly(A) 尾巴在mRNA翻譯和穩定性方面也起着重要的調節作用。因此，必須直接從編碼DNA模板中合成或使用poly(A) 聚合酶將最佳長度的poly(A) 添加到mRNA中。密碼子的使用對蛋白質翻譯有影響。用常用同義密碼子替換稀有密碼子是增加mRNA翻譯蛋白水平的常見做法。

儘管可以通過改變密碼子組成或通過引入修飾的核苷來提高mRNA翻譯蛋白水平，這種方式也可能影響mRNA二級結構、翻譯動力學和準確性以及蛋白質摺疊等等。所有這些因素都可能影響免疫反應的強度或特異性。

優化mRNA藥理學的策略

免疫原性的調節

外源的mRNA具有固有的免疫刺激性，因爲它能夠被各種細胞表面、內體和胞質先天免疫受體識別。

根據治療應用的不同，mRNA的這種特徵可能是有益的，也可能是有害的。對於疫苗接種來說具有潛在優勢，因爲在某些情況下，它可以提供佐劑活性來驅動樹突狀細胞成熟，從而引發強大的T細胞免疫反應和B細胞免疫反應。然而，mRNA的先天免疫感應也與抗原表達的抑制有關，並可能對免疫反應產生負面影響。

有效的體內mRNA遞送對於效果至關重要。外源mRNA必須穿透脂質膜的屏障才能到達細胞質並翻譯成功能性蛋白質。mRNA攝取機制似乎取決於細胞類型，並且mRNA複合物的特性可以深刻影響細胞遞送和器官分佈情況。

目前有兩大類用於遞送mRNA疫苗的基本方法。一類是在體外將mRNA轉染到樹突狀細胞（DCs）中，然後再將轉染的樹突狀細胞輸入體內。另一類是在有或沒有載體的情況下直接注射mRNA。前者能夠精確控制細胞靶標、轉染效率等條件，但作爲一種細胞療法，是一種昂貴且勞動密集型疫苗接種方法。而後者直接注射mRNA的方法更快速且更具經濟效益。

mRNA疫苗的常用遞送方法和載體：a.裸mRNA、b.電穿孔、c.魚精蛋白、d.陽離子納米乳液、e.修飾的樹枝狀納米顆粒、f.魚精蛋白脂質體、g.陽離子聚合物、h.陽離子聚合物脂質體、i.多糖顆粒、j.陽離子脂質納米顆粒、k.陽離子脂質膽固醇納米顆粒、l.陽離子脂質膽固醇PEG納米顆粒。

體外轉染樹突狀細胞（DCs）：樹突狀細胞是免疫系統中最有效的抗原呈遞細胞，能夠引起適應性免疫反應，還可能會將完整的抗原呈遞給B細胞以引發抗體反應。而且樹突狀細胞也非常適合mRNA轉染。由於這些原因，樹突狀細胞成爲體內和體外mRNA疫苗轉染的有吸引力的目標。

儘管裸mRNA可以通過內吞作用進入樹突狀細胞，但電穿孔技術能夠提高轉染效率。電穿孔的mRNA遞送方法因其無需載體分子即可產生高轉染效率的能力而受到青睞。然後將已轉染mRNA的樹突狀細胞重新輸入體內以啓動免疫反應。大多數體外轉染mRNA的 樹突狀細胞疫苗主要引起細胞介導的免疫反應，因此它們主要用於治療癌症。

體內注射裸mRNA：裸mRNA已成功用於體內免疫，特別是在優先靶向抗原呈遞細胞的形式中，如皮內和結內注射。有研究表明，使用編碼腫瘤相關新抗原的裸露、未修飾的 mRNA進行重複結內免疫注射可產生強大的T細胞反應並增加無進展生存期。

體內物理遞送：爲了提高體內mRNA攝取的效率，有研究使用物理方法來穿透細胞膜。例如使用基因槍的方法，將金納米顆粒與mRNA複合後進行注射。近年來，該領域更傾向於使用脂質納米顆粒或聚合物納米顆粒進行遞送。

基於陽離子脂質和聚合物的遞送：在過去幾年中，陽離子脂質和聚合物已成爲廣泛使用的mRNA遞送工具。這受益於對小干擾RNA（siRNA）體內遞送的研究。脂質納米顆粒（LNP）已成爲最具吸引力和最常用的mRNA遞送工具之一。LNP通常由四種成分組成：一種可電離的陽離子脂質，它促進自組裝成病毒大小的顆粒（直徑約100納米），並允許內體將mRNA釋放到細胞質中；脂聯聚乙二醇（PEG），可延長製劑的半衰期；膽固醇，作爲穩定劑；和天然存在的磷脂，以支撐脂質雙層結構。目前已上市的兩款mRNA疫苗均使用脂質納米顆粒（LNP）作爲遞送載體。

開發針對傳染性病原體的預防性或治療性疫苗是控制和預防流行病的最有效手段。然而，傳統疫苗方法在很大程度上未能生產針對引起慢性或反覆感染的具有挑戰性的病毒的有效疫苗，例如HIV-1、單純皰疹病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）。

此外，像2014-2016年埃博拉和寨卡病毒暴發所表明的那樣，基於傳統疫苗的商業疫苗開發和批准的緩慢速度不足以應對迅速出現的急性病毒性疾病。因此，開發更有效、更快速、更通用的疫苗平臺至關重要。

mRNA可以分爲兩種主要類型：非複製mRNA疫苗和自擴增mRNA疫苗。其中非複製mRNA疫苗還可以根據遞送載體分爲兩類：體外轉染樹突狀細胞類型和體內直接注射類型。

直接注射非複製性mRNA疫苗

直接注射、非複製性mRNA疫苗是一種有吸引力的疫苗形式，因爲它們簡單、經濟，特別是在資源有限的環境中。目前已有兩款mRNA疫苗獲得FDA批准上市，分別來自Moderna和BioNTech，均用於預防新冠病毒（SARS-CoV-2）感染。此外，針對HIV-1、寨卡病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）的mRNA也已經開展了人體臨牀試驗。這些均爲直接注射非複製性mRNA疫苗。

自擴增mRNA疫苗

相比直接注射非複製性mRNA疫苗，自擴增mRNA疫苗在mRNA序列中加入了可複製序列，在進入細胞內後可以像病毒一樣，能夠利用宿主細胞進行自我複製，從而在極低注射劑量的情況下，實現抗原的高表達，達到產生較強免疫反應的能力。自擴增mRNA疫苗於2021年7月發佈了針對新冠病毒的1期臨牀試驗結果，該疫苗可在87%的接種者體內產生保護性免疫反應，即使注射劑量遠低於非複製性mRNA疫苗。而且，沒有觀察到短期內的安全問題。

非複製性mRNA疫苗與自擴增mRNA疫苗的比較

樹突狀細胞mRNA疫苗

這種mRNA疫苗是在體外將mRNA轉染到樹突狀細胞，使用這種方法開發的傳染病疫苗主要限於HIV-1治療性疫苗：接受高效抗逆轉錄病毒治療的HIV-1感染者用自體樹突狀細胞治療，這些樹突狀細胞用編碼各種HIV-1抗原的mRNA電穿孔轉染，臨牀試驗顯示這種疫苗是安全的，並引發了抗原特異性CD4+和CD8+T細胞反應，但沒有觀察到臨牀益處。

癌症疫苗和其他免疫療法代表了治療惡性腫瘤的有希望的新策略。癌症疫苗是利用腫瘤抗原誘導機體自身的免疫反應對腫瘤細胞進行特異性殺傷。由於機體的免疫反應具有系統性和全身性的特點，這種療法不僅可以對術後殘留的腫瘤病竈進行特異性殺傷，也能有效作用於遠端轉移的細胞，相比於其他治療方法作用範圍更特異且廣泛。

樹突狀細胞mRNA癌症疫苗

自1996年首次報道了用電穿孔轉染mRNA的樹突狀細胞可以引發針對腫瘤抗原的有效免疫反應後，許多研究和臨牀試驗證實了這種方法的可行性和有效性。目前已經在轉移性前列腺癌、轉移性肺癌、腎細胞癌、腦癌、黑色素瘤、急性髓細胞白血病、胰腺癌等多種癌症中驗證了這種疫苗的潛力。此外，還有多項臨牀試驗顯示，樹突狀細胞mRNA癌症疫苗與傳統化療藥物或免疫檢查點抑制劑聯用具有有希望的改善效果。

直接注射的mRNA癌症疫苗

mRNA疫苗的給藥途徑和遞送方式可以極大地影響結果。目前已經使用常見的遞送途徑（皮內、肌肉內、皮下或鼻內）和一些非常規疫苗接種途徑（結內、靜脈內、脾內或瘤內）開發了多種mRNA癌症疫苗形式。

一些臨牀前研究表明，將mRNA癌症與輔助療法（如傳統化療、放療和免疫檢查點抑制劑）相結合，增加了mRNA癌症疫苗接種的有益結果。

總的來說，mRNA 癌症疫苗已被證明對人類具有免疫原性，進一步改進疫苗接種方法可能需要獲得更大的臨牀益處。

對直接注射mRNA癌症疫苗有效性的思考

隨着mRNA疫苗的獲批上市，mRNA領域開始火熱起來，但目前已上市的兩款mRNA疫苗需要在-20℃甚至-70℃溫度下保存，這遠低於傳統疫苗的保存溫度。因此，還需要繼續努力開發在更高溫度下穩定且更適合疫苗分發的製劑。

現代預防性疫苗對安全性的要求極爲嚴格，因爲這些疫苗是針對健康個體進行的。隨着兩款新冠mRNA疫苗的廣泛接種，表明mRNA是相對安全的疫苗形式，但一些罕見的副作用如心肌炎、面癱等等，也應引起關注和進一步研究。

mRNA疫苗具有多種顯著優勢，mRNA疫苗能夠模擬病毒的天然感染過程來激活免疫系統，可激發潛在更強力的免疫反應；多個mRNA可以被包裝在同一款疫苗中，提高疫苗的適用性；mRNA疫苗的發現和生產與蛋白疫苗相比更爲迅速，對突發流行性感染可以更快作出反應；不同的mRNA疫苗可以使用同一生產步驟和設施。

這些獨特的優勢，讓mRNA疫苗以極爲驚人的速度迅速發展，目前不僅有多種新冠 mRNA疫苗，針對狂犬病、寨卡病毒等傳染病，以及癌症、自身免疫病、罕見遺傳病的mRNA疫苗都在研究之中。

論文鏈接：

1. https://www.nature.com/articles/nrd.2017.243

2. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.06.008