陸軍軍醫大學饒賢才、尚偉龍/盧曙光AM：兼具抗炎抗菌功能的多肽水凝膠，快速促進耐藥金葡菌感染傷口癒合

皮膚感染是一種常見病，幾乎人人都經歷過皮膚化膿性感染。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌）是引起皮膚感染的重要病原菌，臨牀上約50%的皮膚傷口感染可分離出金葡菌。更重要的是，耐藥性金葡菌（如MRSA）感染可大大遲滯了口的癒合，給臨牀治療帶來巨大挑戰。傳統的清創、傷口敷料和負壓等治療方法均有一定侷限性，如紗布、繃帶和棉絮等傷口敷料不能有效殺滅細菌，且頻繁更換敷料還會損傷再生組織，推遲傷口癒合。因此，探尋快速促進感染傷口癒合的有效措施仍是臨牀醫學領域的重大課題之一。

已有研究表明，細菌感染傷口微環境通常呈酸性（pH值4.5–6.5），而自組裝多肽水凝膠是一種極有吸引力的功能材料，但如何設計成多功能且具有pH響應型的多肽仍然具有挑戰性。基於此，陸軍軍醫大學饒賢才教授、尚偉龍副教授/盧曙光副教授及本論文第一作者劉鶴共同研發了一系列pH響應型自組裝多肽。其中，多肽L5的序列中同時具有抗炎三肽（KPV）以及pH響應型抗菌活性的motif（FQFL），在中性條件（pH 7.4）下可以自組裝形成水凝膠，具有生物相容性；在酸性條件下（pH 5.5）表現出廣譜的抗菌活性。L5負載噬菌體內溶素LysSYL（L5@LysSYL）後，可實現內溶素LysSYL在病理條件下的持續緩釋，大大提高了LysSYL的穩定性和生物利用度。轉錄組測序結果揭示了L5@LysSYL可能通過破壞細菌細胞膜、抑制細菌細胞壁形成及延緩細胞分裂等多種協同機制導致細菌死亡。更重要的是，水凝膠L5@LysSYL可通過殺菌、降炎及促進血管生成基因表達等方式促進耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）感染小鼠皮膚傷口癒合，具有良好的臨牀應用開發前景。相關研究工作以“LysSYL-loaded pH-switchable self-assembling peptide hydrogels promote methicillin-resistant Staphylococcus aureus elimination and wound healing”爲題發表在《 Advanced Materials》上。

Scheme 1:pH響應型自組裝多肽L5負載內溶素LysSYL（L5@LysSYL）治療MRSA感染小鼠傷口癒合的示意圖。

圖1：基於抗菌活性及生物相容性實驗篩選自組裝多肽。作者利用氨基酸的特性和多肽motif設計了9條自組裝多肽，實驗證實有6條多肽可以自組裝形成水凝膠。對這6條多肽的抗菌活性、生物相容性和溶血活性進行檢測，結果L5的生物相容性最好，可用於遞送內溶素金葡菌噬菌體內溶素LysSYL。

圖2：水凝膠L5的自組裝機制和表徵。L5在中性條件（pH 7.4）可以通過非共價相互作用（靜電、氫鍵和疏水作用）自組裝形成水凝膠，在酸性條件（pH 5.5）下由於靜電斥力導致多肽質子化，從而發揮抗菌作用。小瓶倒置法觀察顯示L5具有pH敏感的成膠特性，圓二色譜結果進一步證實不同pH可以顯著影響L5的二級結構。流式細胞儀檢測結果證明L5可以穿過金葡菌USA300和銅綠假單胞菌的細胞膜。

圖3：水凝膠L5的抗菌活性檢測。激光共聚焦和掃描電鏡結果進一步證明L5具有pH響應型的抗菌活性，可以通過與細菌細胞膜相互作用導致細菌死亡。此外，L5在酸性條件（pH 5.5）下還具有緩釋功能和廣譜抗菌活性。由於L5序列中具有一段廣譜抗菌活性的Clavanin A多肽motif（FQFL），這可能也是L5具有廣譜抗菌活性的重要原因。

圖4：水凝膠L5的形貌表徵。作者通過冷凍電鏡、透射電鏡和原子力顯微鏡觀察，揭示了L5在中性條件下（pH 7.4）可以形成均勻交織的三維多孔結構，平均孔徑爲5.6 µm，這爲藥物遞送提供了適宜的超分子網絡。在酸性條件下，由於L5序列中K和H殘基的質子化，水凝膠的三維超分子網絡結構在酸性條件（pH 5.5）下被拆解和破壞。

圖5：水凝膠L5@LysSYL的表徵。L5負載內溶素LysSYL後，可以使內溶素LysSYL的熱穩定性提高21.7%。流變力學實驗結果表明，水凝膠L5負載內溶素LysSYL後的機械性能提高。傅里葉紅外光譜結果證實LysSYL的負載沒有影響L5水凝膠的結構。冷凍電鏡、透射電鏡和原子力顯微鏡表徵結果同樣證實了L5@LysSYL具有與L5類似的三維多孔網狀結構，但L5@LysSYL的平均孔徑（22.5 µm）顯著大於L5水凝膠（5.6 µm，P<0.01）。在72 h時，L5@LysSYL在pH 7.4和pH 5.5條件下的累積藥物釋放百分比分別達17.9%和83.6%，表明在感染傷口環境（pH 5.5）條件下，L5@LysSYL具有pH敏感的釋放特性。

圖6：水凝膠L5@LysSYL的抗菌活性及抗菌機制。作者通過活菌計數法和生長曲線測定，證實L5@LysSYL具有協同增效的抗菌效能。轉錄組測序結果表明，金葡菌USA300經水凝膠L5@LysSYL處理後，共鑑定出429個差異表達基因，其中187個基因上調，242個基因下調，提示L5@LysSYL水凝膠可能通過多種協同作用機制，如破壞細菌細胞膜、抑制細胞壁形成、延緩細胞分裂等方式導致細菌死亡。

圖7：水凝膠L5@LysSYL促進耐藥金葡菌感染小鼠傷口的癒合。作者構建了小鼠全層皮膚金葡菌USA300（MRSA）傷口感染模型，評估水凝膠L5@LysSYL促進傷口癒合的潛力。結果發現L5@LysSYL水凝膠治療組小鼠在第7和14天均顯示出最優的傷口癒合效果。定量檢測顯示，L5@LysSYL水凝膠治療組的小鼠創面癒合速率最快。在第14天，水凝膠L5@LysSYL處理組的小鼠創面未癒合面積僅爲4.9%，顯著低於其他處理組。在水凝膠L5@LysSYL治療14天后，傷口組織的細菌數量降低6個數量級，明顯低於LysSYL處理組。L5@LysSYL處理組的細胞因子和趨化因子的變化程度較LysSYL或L5單獨處理組更爲明顯，表明水凝膠L5@LysSYL治療可加快傷口癒合中由炎症向再生過程轉變。

圖8：L5@LysSYL水凝膠通過上調參與組織再生的基因表達水平加速傷口癒合。H&E染色結果表示，L5@LysSYL水凝膠處理組在第14天表現出正常的皮膚結構，皮下纖維組織排列有序，炎症基本消失。對膠原沉積量化結果分析顯示，在第14天，L5@LysSYL處理組的膠原蛋白沉積比率最高，與正常對照組相當。與PBS處理組相比，經過L5@LysSYL水凝膠處理後，vegf、egf和fgf基因的表達水平顯著上調。

圖9：實驗小鼠皮膚組織的免疫組化染色分析。CD31被認爲是血管內皮細胞標記物，通過免疫組織化學染色對新生血管的數量進行分析，發現水凝膠L5@LysSYL處理後CD31表達量明顯高於PBS處理組，表明水凝膠L5@LysSYL治療後創面組織血管新生增強。此外，L5@LysSYL水凝膠處理後，血管內皮生長因子（VEGF）表達量最高，表明水凝膠L5@LysSYL可能促進創傷組織血管的生成與功能重建。

來源：高分子科學前沿

聲明：僅代表作者個人觀點，作者水平有限，如有不科學之處，請在下方留言指正！